癌症为细胞恶性增生所致，有侵袭性，可转移。手术切除、放疗和化疗相结合是治疗癌症的基本手段。然而，这几种治疗方式都存在许多的局限性，比如达不到手术切除的条件、放射治疗和化疗药物无法选择性靶向人体患病细胞等。因此，合成特定的药物，使其选择性地靶向患病细胞成为众多医药企业的努力的方向。2018年罗氏公司公布了一项专利，他们发现3 羰基氨基 8 氨基异喹啉化合物可以作为HPK1的抑制剂，与其它药物组合后可以增强免疫应答和治疗HPK1依赖性病症（诸如癌症）。通过对大量3 羰基氨基 8 氨基异喹啉化合物的筛选，他们发现GNE-6893可以用于改善T细胞受体的信号传导以及增加细胞因子的产生，从而提高抗肿瘤免疫力。

(资料图)

专利报道的GNE-6893第一代合成路线（见图1）主要包括7步（未将6和7的合成计入），总收率为2.07%，收率较低，不适合作为公斤级原料药的生成路线。作者认为该路线主要存在两个问题：

其一，实验手性呋喃醇3的合成。

其二，高度官能团化的异喹啉化合物的后期修饰。

图1：GNE-6893的第一代合成路线

带着这样的想法，作者对GNE-6893进行了逆合成分析，主要包括氨基甲酸酯的形成、Buchwald-Hartwig 酰胺化反应构建C(sp2)-N键、手性呋喃醇的制备以及Suzuki-Miyaura反应构建C(sp2)-C(sp2)键。带着这样的想法，作者对第一代合成路线进行了优化，以用于实验公斤级原料药的合成。

图 2：GNE-6893的逆合成分析

PART.1

优化手性呋喃醇合成

环氧化合物和甲基氯化镁反应可得到反式-4-甲基-3-呋喃醇(3a)，随后经酯化反应可得到3b（图3）。筛选277个酶后，作者发现EL012可以实现消旋化合物3b的拆分，并可以99.2%的ee值和34%的分离收率得到(3S,4R)-4-甲基-3-呋喃醇(3)。相比于第一代路线，优化后的公斤级路线仅需对小分子化合物3b进行拆分，而无需对1b脱保护后、分子量较大的化合物进行拆分，优化后的路线对含异喹啉骨架的母核利用率较高，这也是汇聚式合成路线的优势之一。

图3：(3S,4R)-4-甲基-3-呋喃醇(3)的合成

PART.2

优化C(sp2)-C(sp2)键的构建

通过对钯催化剂和配体的大量筛选，作者发现在Pd(OAc)2/(t-Bu)2PMe·HBF4的催化条件下，可以72%的分离收率得到6a，并将价格昂贵的钯催化剂的当量从0.2降到了0.03。仅在0.01当量Pd(dppf)Cl存在下，以Cs2CO3为碱，6a和7可通过Suzuki-Miyaura反应得到化合物5a。由于回收率低，6a的结晶工艺无法被开发出来。为了规避6a的重结晶，作者将硼化反应和Suzuki-Miyaura反应进行了连投，然而仅有49.3%的HPLC收率（图4，Condition A）。反应之所以收率低，是因为6a在Condition A中的第二步反应中会发生分解。鉴于，芳基卤化物的锂化-硼化和后续的Suzuki Miyaura反应的连投已有相关报道。作者对此进行了尝试（图4，Condition B），并可以两步85%的收率得到产物5a。

图4：C(sp2)-C(sp2)键的构建

PART.3

优化氨基保护

在第一代路线中，需加入分子筛除水以实验5a的进一步转化。在本文中，作者采用共沸蒸馏代替分子筛实现了5a的完全转化，并将分离收率从72%提高至89%。相比于第一代路线，操作更为简单实用。

图5：氨基的保护

PART.4

优化Buchwald-Hartwig 酰胺化反应

通过对碱(K2CO3, K3PO4, KOAc, tBuONa)、溶剂(1,4-dioxane, toluene, t-amyl alcohol)以及催化剂(N-XantPhos Pd G3, Pd(OAc)2/DPEPhos, XantPhos Pd G3, t-BuBrettPhos Pd G3, BuBrettPhos Pd G3, RuPhos Pd G3, XPhos Pd G3, PCy3 Pd G3)的全组合筛选，由于1,4-dioxane具有致癌性，最终作者选定BrettPhos Pd G3/K2CO3/toluene的组合为最佳反应条件（图6）。在此基础上，作者通过控制变量法，对催化剂的用量、BocNH2的当量以及温度进行了优化（图7），并确定了反应的最佳条件。在该反应中，作者发现通过甲苯共沸蒸馏后的BocNH2具有更佳的反应效果（图7, entry 5 和 entry 7）。

图6：胺化反应-钯催化剂和碱的优化

图7：胺化反应-温度、催化剂和胺当量的优化

PART.5

优化2a的脱保护基步骤

在第一代路线中，水合肼被用来实现2a的脱保护。考虑到在放大过程中水合肼有较大的安全隐患，容易发生爆炸事故，作者用甲胺代替水合肼，并可以两步75%的分离收率成功得到化合物2。

图8：氨基保护基的脱除

PART.6

优化氨基甲酸酯1b合成

在第一代路线中，三光气被用来实现1b的合成。考虑到三光气具有非常强的毒性，在放大生产中存在安全隐患，作者将氨基甲酸酯的合成拆分成两步，即先生成活性较高的氨基甲酸酯1a，再与手性呋喃醇3发生酯交换实现1b的合成。首先，在第一步中，作者对偶联试剂进行了考察，发现偶联试剂为N,N"-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC）时，2的转化率和1a的HPLC收率最高（图9）；随后，在保持偶联试剂为DSC的基础上，作者对第二步的酯交换反应中涉及的碱、温度、添加剂以及手性呋喃醇的当量进行了考察（图10）。当保持温度为0 oC，在加入分子筛的情况下，对不同的碱进行考察时，发现无论是在step 1 还是在step 2中， DABCO为碱时，1a和1b的收率均优于DMAP, NMI和NMM，且副产物2-urea较少（图10, entry 1-8）。考虑到后续的放大，作者将分子筛控除，并升温至25 oC，对比了DABCO和NMI对反应的影响。在step 1中，以NMI为碱时效果优于DABCO，但是在step 2中，以DABCO为碱效果优于NMI（图10, entry 9-10）。当以NMI为碱时，在step 2升温至40 oC时，1b的收率可以得到明显的提高（图10, entry 11）。在图10, entry 11的条件下进行放大，经柠檬酸水溶液洗涤，环戊基甲基醚（CPME）重结晶，可以62%的分离收率得到1b。

图9：合成1a的偶联试剂的筛选

图10：氨基甲酸酯1b的合成优化

PART.7

优化1b中两个Boc保护基的脱除

在第一代路线中，TFA/DCM被用来实现Boc保护基的脱除。不幸的是，GNE-6893中氨基甲酸酯部分在TFA/DCM的条件下会继续发生降解，得到相应的胺，从而导致反应收率较低（34%）。通过对比盐酸和硫酸的条件，以乙腈和水作为混合溶剂，作者很快确定了反应的最佳条件，并最终以94%的分离收率得到了最终的产物GNE-6893。

图11：氨基甲酸酯1b的脱保护

7步总收率为33%，相较于第一代路线(总收率2.07%)，总收率提高了15倍；

采用了汇聚式路线，将手性呋喃醇3和含异喹啉骨架的化合物2进行了分别的合成，提高了2的利用率；

采用酶催化对反式呋喃醇进行拆分得到了光学纯的呋喃醇3；

避免了使用危险试剂，以甲胺和DSC分别代替水合肼和三光气，工艺更为安全，更加符合绿色化学的标准；

GNE-6893的合成中涉及到了多步钯催化的反应，作者将催化剂的当量降低到了3-5 mol%，大大节约了成本，且钯催化的反应均在路线的前几步，设计合理，大大减少了后续API中金属残留问题；

在公斤级路线中，多次实现了一锅法，如step 1和step 2、step 4和step 5的连投，大大简化了实验操作。

图12：GNE-6893公斤级生产路线

参 考 文 献

【1】Liang, J.; Mendonca, R.; Siu, M.; Tellis, J. C.; Wang, W.; Wei, B.; Chan, B.; Choo, E. F.; Drobnick, J. A.; Gazzard, L. J.; Heffron, T. 8-Aminoisoquinoline Compounds and Uses Thereof. WO 2020/ 072695 A1, April 09, 2020.

【2】Stumpf, A. Xu, D. Ranjan, R. Angelaud, R. Gosselin, Francis. A Convergent Synthesis of HPK1 Inhibitor GNE-6893 via Palladium-Catalyzed Functionalization of a Tetrasubstituted Isoquinoline. Org. Process Res. Dev. DOI: org/10.1021/acs.oprd.2c00384.